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高压制备液相色谱分离纯化的放大研究
2014-08-14查看:
利用高压制备液相色谱装备对千层塔中的石杉碱甲进行了分离提纯放大研究，考察了填料大小、柱尺寸大小与上样...
近年来，从自然资源中提取具有生物活性化合物的研究日益引起了人们的广泛关注。源于植物中的抗肿瘤药物紫杉醇及抗疟活性成分青蒿素的发现促使人们特别是工业界人士开展更广泛的研究。研究人员竭力研究高效的分离筛选方法，试图从植物、海洋生物及微生物等自然资源中发现新的有效化合物，同时也需要一个快速、有效的分离方法以分离目标化合物。因此，学术界及工业界都需要有效的制备分离技术及其应用经验。
高压制备液相色谱是一种使用高压、大流量输送系统在高分辨率、大内径、高载量分离柱上进行样品高纯度分离的液相色谱制备方法。应用该方法分离的产品在纯度、回收率、分离效率等方面远远优于传统的制备方法，因此在生物制品、药物研究和生产领域都得到了广泛应用。
在对高压制备液相色谱分离纯化过程进行优化时，影响分离纯化效果的因素有很多，包括填料尺寸大小、色谱柱的柱径、柱长、上样量以及流动相的组成、流速等。将分析系统放大到制备型液相色谱意味着需要使用更大的制备柱、更高的流速和根据色谱柱的长度增加进样量，在分析型液相色谱中，研究者已广泛研究过填料尺寸、柱尺寸大小以及上样方式等对分离效率的影响，但对制备型液相色谱分离纯化过程进行优化的研究却鲜有报道。
本文利用自行生产的高压制备液相色谱装备，对千层塔中的石杉碱甲的制备分离过程进行了实验研究，着重考察了填料大小、柱尺寸大小以及上样方式对柱效和分离度的影响。
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
DASIO C18填料（dp=10、20、30、40 μm，苏州麦可旺志生物技术有限公司）；高压制备液相色谱柱（ID 50 mm×650 mm、ID 50 mm×1 000 mm、ID 150 mm×650 mm）；动态轴向加压液压站（聊城万合工业制造有限公司）；制备高压输液泵：GLP3250；紫外-可见检测器：UC-3292；Rheodyne3725i六通进样阀；色谱工作软件及电脑。此外，还有高效液相色谱仪、高速离心机、旋转蒸发仪。
氯仿、甲醇、氨水、硫酸、氢氧化钠、纯水均为分析纯，石杉碱甲对照品（99.1%含量）。千层塔来源于重庆，经鉴定符合中华人们共和国药典（2010版）规定，均为分析纯试剂，使用前先经过整流处理再用孔径为0.45 μm的微孔滤膜过滤。
1.2 工艺流程及方法
本文所建立的高压制备液相色谱装备分离工艺流程如图1所示。样品被注入色谱柱后，通过高压制备输液泵的压力使洗脱液带动样品在固定相中移动，样品组分依据两相间作用能力的差别达到分离的目的，分离后的各组分经检测器检测，再经过工作站软件和数据处理系统的运算处理以图谱的形式呈现，最后通过馏分收集器分通道收集。
图1 高压制备液相色谱装备分离工艺流程图
高压制备液相色谱是一种使用高压、大流量输送系统在高分辨率、大内径、高载量分离柱上进行样品高纯度分离的液相色谱制备方法。应用该方法分离的产品在纯度、回收率、分离效率等方面远远优于传统的制备方法，因此在生物制品、药物研究和生产领域都得到了广泛应用。
在对高压制备液相色谱分离纯化过程进行优化时，影响分离纯化效果的因素有很多，包括填料尺寸大小、色谱柱的柱径、柱长、上样量以及流动相的组成、流速等。将分析系统放大到制备型液相色谱意味着需要使用更大的制备柱、更高的流速和根据色谱柱的长度增加进样量，在分析型液相色谱中，研究者已广泛研究过填料尺寸、柱尺寸大小以及上样方式等对分离效率的影响，但对制备型液相色谱分离纯化过程进行优化的研究却鲜有报道。
本文利用自行生产的高压制备液相色谱装备，对千层塔中的石杉碱甲的制备分离过程进行了实验研究，着重考察了填料大小、柱尺寸大小以及上样方式对柱效和分离度的影响。
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
DASIO C18填料（dp=10、20、30、40 μm，苏州麦可旺志生物技术有限公司）；高压制备液相色谱柱（ID 50 mm×650 mm、ID 50 mm×1 000 mm、ID 150 mm×650 mm）；动态轴向加压液压站（聊城万合工业制造有限公司）；制备高压输液泵：GLP3250；紫外-可见检测器：UC-3292；Rheodyne3725i六通进样阀；色谱工作软件及电脑。此外，还有高效液相色谱仪、高速离心机、旋转蒸发仪。
氯仿、甲醇、氨水、硫酸、氢氧化钠、纯水均为分析纯，石杉碱甲对照品（99.1%含量）。千层塔来源于重庆，经鉴定符合中华人们共和国药典（2010版）规定，均为分析纯试剂，使用前先经过整流处理再用孔径为0.45 μm的微孔滤膜过滤。
1.2 工艺流程及方法
本文所建立的高压制备液相色谱装备分离工艺流程如图1所示。样品被注入色谱柱后，通过高压制备输液泵的压力使洗脱液带动样品在固定相中移动，样品组分依据两相间作用能力的差别达到分离的目的，分离后的各组分经检测器检测，再经过工作站软件和数据处理系统的运算处理以图谱的形式呈现，最后通过馏分收集器分通道收集。
图1 高压制备液相色谱装备分离工艺流程图
2 结果与讨论
2.1 填料大小的影响
在高效液相色谱中，分离过程中的柱效、负荷能力及压降受到填料尺寸的影响。在分析液相色谱中，研究者已广泛研究过填料大小对分离效果的影响。但在制备液相色谱中，对填料尺寸进行优化研究却少有报道。Eisenbeib等对不同填料大小的制备液相色谱过程进行了研究，认为在制备液相色谱中，使用大颗粒填料并适当增加柱长，可使分离效果基本不下降。从目前的研究现状来看，有关制备液相色谱的色谱填料尺寸优化问题还没有得到很好的解决。本文利用自行设计的高压制备液相色谱分离装备，通过千层塔中石杉碱甲的分离纯化，对填料尺寸对分离性能的影响进行了研究。过程分离性能以石杉碱甲的分离度及柱效来表示。
为考察填料大小对制备分离效果的影响，本文采用不同大小的色谱填料，对高压制备液相色谱过程进行了研究。图2给出了不同粒径下流动相流速对柱效的影响。结果表明，当其他条件相同时，柱效随填料粒径的增大而降低。
图2 不同粒径下流动相流速对柱效的影响
2.1 填料大小的影响
在高效液相色谱中，分离过程中的柱效、负荷能力及压降受到填料尺寸的影响。在分析液相色谱中，研究者已广泛研究过填料大小对分离效果的影响。但在制备液相色谱中，对填料尺寸进行优化研究却少有报道。Eisenbeib等对不同填料大小的制备液相色谱过程进行了研究，认为在制备液相色谱中，使用大颗粒填料并适当增加柱长，可使分离效果基本不下降。从目前的研究现状来看，有关制备液相色谱的色谱填料尺寸优化问题还没有得到很好的解决。本文利用自行设计的高压制备液相色谱分离装备，通过千层塔中石杉碱甲的分离纯化，对填料尺寸对分离性能的影响进行了研究。过程分离性能以石杉碱甲的分离度及柱效来表示。
为考察填料大小对制备分离效果的影响，本文采用不同大小的色谱填料，对高压制备液相色谱过程进行了研究。图2给出了不同粒径下流动相流速对柱效的影响。结果表明，当其他条件相同时，柱效随填料粒径的增大而降低。
图2 不同粒径下流动相流速对柱效的影响
注：理论塔板高度值越大，柱效越低。
对于高压制备液相色谱，在超载程度不是很高的情况下，分析型液相色谱的分离度公式仍可使用：
图4 不同粒径下柱压与流速的关系
对于高压制备液相色谱，在超载程度不是很高的情况下，分析型液相色谱的分离度公式仍可使用：
式中 R——分离度
a——相对保留值
R、——容量因子
L——柱长，mm
H——塔板高度，mm
由以上公式可以看出，分离度与理论塔板高度的平方根成反比，与柱效则成正比。由于柱效随填料粒径的增大而降低，则分离度随填料粒径的增大而下降。图3给出了不同粒径下流动相流速对石杉碱甲分离度的影响，结果表明，当其他条件相同时，石杉碱甲的分离度随填料粒径的增加而下降。
图3 不同粒径下流动相流速对石杉碱甲分离度的影响
a——相对保留值
R、——容量因子
L——柱长，mm
H——塔板高度，mm
由以上公式可以看出，分离度与理论塔板高度的平方根成反比，与柱效则成正比。由于柱效随填料粒径的增大而降低，则分离度随填料粒径的增大而下降。图3给出了不同粒径下流动相流速对石杉碱甲分离度的影响，结果表明，当其他条件相同时，石杉碱甲的分离度随填料粒径的增加而下降。
图3 不同粒径下流动相流速对石杉碱甲分离度的影响
从上可以看出，采用小颗粒色谱填料可以提高柱效和分离度，但是，颗粒越小，柱压就越大。图4是在不同粒径下柱压与流速的关系曲线，结果表明，粒径减小时柱压增大，且会受到泵能力的影响。
图4 不同粒径下柱压与流速的关系
综上，高压制备液相色谱分离过程使用小颗粒填料，可获得良好的分离性能，柱效高，分离效果好。但是，小颗粒填料价格较贵，并且对泵的要求会提高，从而增加成本。故在可以满足分离要求的前提下，尽量使用大颗粒填料，以提高生产能力，并且价格较低，节省成本。
2.2 柱尺寸大小的影响
迄今为止，在制备液相色谱中，Godbile等研究了分离过程中柱尺寸大小对制备量的影响，Knox等发现大直径柱可获得较高的柱效，但柱尺寸对分离性能的研究还不够完善，需要进一步深入研究，这是制备液相色谱技术能否大规模应用于工业分离过程的关键所在。本文利用自行设计的高压制备液相色谱分离装备，通过对千层塔中石杉碱甲的分离纯化，研究了柱尺寸对分离性能的影响。
2.2.1 柱长的影响
为考察柱长对制备分离效果的影响，本文采用ID 50 mm×650 mm、ID 50 mm×1 000 mm这2种不同柱长的柱子，对高压制备液相色谱分离过程进行了研究。图5给出了不同柱长下流动相流速对柱效的影响，结果表明，当其他条件相同时，柱效随柱长的增大而降低；图6是不同柱长下流动相流速对分离度的影响，结果表明，当其他条件相同时，柱长增大，可显著提高分离度。
2.2 柱尺寸大小的影响
迄今为止，在制备液相色谱中，Godbile等研究了分离过程中柱尺寸大小对制备量的影响，Knox等发现大直径柱可获得较高的柱效，但柱尺寸对分离性能的研究还不够完善，需要进一步深入研究，这是制备液相色谱技术能否大规模应用于工业分离过程的关键所在。本文利用自行设计的高压制备液相色谱分离装备，通过对千层塔中石杉碱甲的分离纯化，研究了柱尺寸对分离性能的影响。
2.2.1 柱长的影响
为考察柱长对制备分离效果的影响，本文采用ID 50 mm×650 mm、ID 50 mm×1 000 mm这2种不同柱长的柱子，对高压制备液相色谱分离过程进行了研究。图5给出了不同柱长下流动相流速对柱效的影响，结果表明，当其他条件相同时，柱效随柱长的增大而降低；图6是不同柱长下流动相流速对分离度的影响，结果表明，当其他条件相同时，柱长增大，可显著提高分离度。
图5不同柱长下流动相流速对柱效的影响
图6不同柱长下流动相流速对分离度的影响
图7是不同柱长下流动相流速对压力降的影响，可以看出，虽然增加柱长可以显著提高分离度，但是也使柱压明显提高，对泵要求也相应提高。因此，在高压制备液相色谱分离过程中，为了提高分离效率，获得较高的分离度，对于较难分开的化合物，可以采取增加柱长的办法；但若在可以满足分离要求的前提下，考虑到成本，要尽可能采用短柱来进行分离。
图7 不同柱长下流动相流速对压力降的影响
图7 不同柱长下流动相流速对压力降的影响
2.2.2 柱径的影响
为考察柱径对制备分离效果的影响，本文采用ID 50 mm×650 mm、ID 150 mm×650 mm这2种不同柱径的柱子，对高压制备液相色谱分离过程进行了研究。图8给出了不同柱径下流动相流速对柱效的影响，结果表明，当其他条件相同时，柱效随柱径的增大而降低。图9是不同柱径下流动相流速对分离度的影响，结果表明，当其他条件相同时，柱径增大，分离度下降。可见增大柱径，会使总的分离性能下降，但大柱径可以提高柱容量，增加制备量。故在可以满足分离要求的前提下，要尽可能的采用大柱径柱子来进行分离。
图8柱径对柱效的影响
图9柱径对分离度的影响
为考察柱径对制备分离效果的影响，本文采用ID 50 mm×650 mm、ID 150 mm×650 mm这2种不同柱径的柱子，对高压制备液相色谱分离过程进行了研究。图8给出了不同柱径下流动相流速对柱效的影响，结果表明，当其他条件相同时，柱效随柱径的增大而降低。图9是不同柱径下流动相流速对分离度的影响，结果表明，当其他条件相同时，柱径增大，分离度下降。可见增大柱径，会使总的分离性能下降，但大柱径可以提高柱容量，增加制备量。故在可以满足分离要求的前提下，要尽可能的采用大柱径柱子来进行分离。
图8柱径对柱效的影响
图9柱径对分离度的影响
2.3 上样方式的影响
在高压制备液相色谱中，厂家为节省成本，必然要尽可能的提高分离效率并增加产量。为提高产量，可采用柱超载的上样方式，柱超载分为2种：质量超载（使用较小的样品注入体积，增加样品浓度）和体积超载（保持较低的样品浓度，增加样品的注入体积）。高压制备液相色谱中，在满足分离要求的前提下，尽可能采用质量超载的方式进样，可以显著提高进样量。当一次需要处理的上样量太大，导致浓度过高或分离效果达不到要求时，宜采用体积超载的方式进样。
3 结语
利用高压制备液相色谱装备对千层塔中的石杉碱甲进行分离提纯，考察了填料大小、柱尺寸大小与上样方式对柱效和分离度的影响。结果表明：在制备分离过程中，小颗粒填料、长柱、小直径柱可提高分离效率；在可满足分离要求的前提下，大颗粒填料、短柱、大直径柱可提高生产能力；在满足分离要求的前提下，采用柱超载操作方式，可提高制备量。
在高压制备液相色谱中，厂家为节省成本，必然要尽可能的提高分离效率并增加产量。为提高产量，可采用柱超载的上样方式，柱超载分为2种：质量超载（使用较小的样品注入体积，增加样品浓度）和体积超载（保持较低的样品浓度，增加样品的注入体积）。高压制备液相色谱中，在满足分离要求的前提下，尽可能采用质量超载的方式进样，可以显著提高进样量。当一次需要处理的上样量太大，导致浓度过高或分离效果达不到要求时，宜采用体积超载的方式进样。
3 结语
利用高压制备液相色谱装备对千层塔中的石杉碱甲进行分离提纯，考察了填料大小、柱尺寸大小与上样方式对柱效和分离度的影响。结果表明：在制备分离过程中，小颗粒填料、长柱、小直径柱可提高分离效率；在可满足分离要求的前提下，大颗粒填料、短柱、大直径柱可提高生产能力；在满足分离要求的前提下，采用柱超载操作方式，可提高制备量。
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