山茱萸（Cornus officinalis Sisb. Et Zucc.）又名枣皮，是山茱萸科山茱萸的干燥果肉，具有降低血压，抗氧化，抗癌的功效，可以补益肝肾，涩精固脱，其有效成分为马钱苷，熊果酸等^[1]。山茱萸主要分布在陕西，河南，四川等地^[2]。

马钱苷是一种萜苷类化合物，在调节免疫，预防心血管疾病方面具有有效作用^[3-4]。鉴于现行2010版《中国药典》以马钱苷作为含量测定指标，以控制山茱萸药材质量，且目前关于提取分离马钱苷的文献报道鲜少。制备型高效液相色谱（Pre-HPLC）作为一种高效的分离纯化技术，有着分离效率高，单次分离时间短等优点。为更深层次利用山茱萸等中药材，控制相关药品质量，我们采用Pre-HPLC法，运用本实验室装填的动态轴向压缩色谱柱，从中药山茱萸中分离高纯度的马钱苷。

1  实验方法

1.1  仪器

制备型高压高效液相色谱柱（ID63×630mm）、动态轴向加压液压站：聊城万合工业制造有限公司；制备高压输液泵：GLP3250；紫外—可见检测器：UC-3292；Rheodyne3725i六通进样阀（配5ml定量环）；色谱工作软件及电脑。高效液相色谱仪，高速离心机，旋转蒸发仪。

1.2  试剂与试药

二次重蒸水；甲醇，乙腈（均为工业级，使用前先经过整流处理再用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤）；薄层色谱硅胶、柱色谱硅胶、球形硅胶（富士硅化学有限公司）；大孔吸附树脂；山茱萸药材购自河南；马钱苷对照品（99%含量）。

1.3样品的处理

将山茱萸药材粉碎，称取粉末4kg，加入6倍量的95%乙醇浸泡24小时，回流提取2次，每次2h，滤过，合并滤液，滤液回收乙醇，减压浓缩至无乙醇味。浓缩液用离心机以10000rpm的转速离心3min，取上层澄清液，即为山茱萸提取液。

1.4大孔树脂富集苷类

取大孔吸附树脂1kg，乙醇浸泡3d，倾去上浮物，湿法装柱。用乙醇清洗，至流出液与水混合不呈现白色乳浊现象即可，然后用大量蒸馏水清洗柱中乙醇，水浸泡备用。将1.3节山茱萸提取液吸附于大孔树脂柱，用6000ml蒸馏水、30%乙醇约15000ml依次洗脱，将乙醇洗脱部分浓缩，浸膏备用。

1.5硅胶柱色谱纯化

硅胶（100-200目）2kg,湿法装柱，取1.4节所得浸膏与等量硅胶的拌料，上样，柱色谱分离，用氯仿-甲醇溶剂系统以体积比15:1，12:1，9:1，6:1，3:1梯度洗脱，收集氯仿-甲醇9:1的馏分，减压浓缩后过滤，得白色固体。

1.6高效型液相色谱纯化

液相色谱制备条件：球形硅胶填料（ID63×630mm）：流动相：甲醇-水（体积比38:62）；流速：150ml/min；检测波长：236nm。

称取2kg硅胶加入3000ml甲醇超声，搅拌30min脱气，将搅拌好的硅胶缓慢注入柱体内，沉降30min，装好柱头密封元件，轴向加压压缩柱床至出液管无液体流出。将1.5所得白色固体溶解于甲醇-水（38:62）中，抽取10-15ml经针式滤膜过滤，舍弃初滤液，续滤液收集至洁净容器中备用。手动进样针进样。收集保留时间为7.5min的组分，见图1。收集液干燥后得白色晶体。

2  结果测定

2.1  结构确定

马钱苷：白色晶体，易溶于甲醇、水。¹³C-NMR（500MHz，CD₃SOCD₃）δ：168.245（11-C），150.985（3-C），112.856（4-C），97.526（1’-C），96.459（1-C），75.896(5’-C)，75.125(3’-C)，73.985(7-C)，72.563(2’-C)，69.103(4’-C)，60.142(6’-C)，51.871(12-C)，44.328(9-C)，39.523(6-C)，39.103(8-C)，29.623(5-C)，10.985(10-C)，NMR数据与文献报道^[5]一致，结构确定为马钱苷。

2.2 定性测定

将所得的马钱苷在硅胶板上点样，马钱苷对照品溶液作对照，氯仿—甲醇为展开剂，晾干，硫酸溶液为显色剂，吹风机吹干，马钱素样品为与对照溶液相同的紫红色斑点，Rf值为0.52。

2.3 定量测定

将马钱苷对照品准确称取5mg，用甲醇配制成0.05mg/ml的溶液100ml，作为对照品溶液。

精密称取制得的马钱苷单体25mg，加甲醇-水盐酸（体积比30:70）混合液25ml，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，用微孔滤膜（0.5μm ）滤过待用。

高效液相色谱分析条件：C18（ID4.6×250mm）：流动相：甲醇-水（体积比30:70）；流速：1.0ml/min；检测波长：236nm。在此色谱条件下，马钱苷对照品为一个主峰，归一化面积百分比达98%以上

3讨论

现代研究表明，马钱苷为山茱萸中的主要活性成分，为药典^[2]中控制其药材质量以及相关中成药质量的指标成分。用上述制备方法进行提取、分离、纯化，操作方便，重现性好，符合对照品的纯度要求，因而可作为对照品使用。

根据山茱萸中主要活性成分—马钱苷的理化性质，在提取纯化工艺中，采用大孔吸附树脂精制苷类，大大提高了马钱苷的富集量，除去大量杂质。富集后的样品通过硅胶柱色谱进一步分离纯化，可得到马钱苷粗品。粗品通过制备型高效液相色谱再次处理纯化，从核磁共振谱图，薄层色谱图，分析型高效液相色谱图，可确定样品结构，纯度符合标准，可作为对照品。

参考文献

[1]  中华本草. 国家中医药管理局中华本草编辑委员会,1999

[2]  国家药典委员会编. 山茱萸. 中华人民共和国药典（1部）. 北京：化学工业出版社,2010:26

[3]  谢宗万. 全国中草药汇编（上册）[M].北京：人民卫生出版社,1975.

[4]  孙文基、谢世昌主编. 天然药物成分定量分析,中国医药科技出版社，2003年1月，第一版

[5]  刘铮等. 化学世界. 1996,（7）：355-358

[6]  沙世炎等. 中草药有效成分分析法