赵新燕

（聊城万合工业制造有限公司，山东 聊城252022）

石杉碱甲(Huperzine A)是从石杉科植物千层塔[Huperziaserrata(Thumb.)Trev(又名蛇足石杉)]中分离得到的生物碱。它是一种强效、低毒的可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂^[1-3]，可用来治疗重症肌无力、跌打损伤和老年痴呆等症^[4-5]。石杉碱甲片剂已通过卫生部审批，在国内出售并部分出口国外^[6]。

石杉碱甲治疗指数很高^[7-9]，但在天然产物中的含量很低。传统的提取工艺是将生药通过溶剂萃取，上柱层析分离，重结晶等工序。所要求的技术含量高，要经过多次层析，反复重结晶，才能达到较高纯度，产量低，条件不易控制，周期长，成本高。本文采用制备型高效液相色谱分离了石杉碱甲，分离工艺简单，提取率高，所得石杉碱甲质量分数较高（90%以上），为进一步利用制备型高效液相色谱法工业规模生产石杉碱甲提供了实验依据。

1  实验部分

1.1  仪器

高效液相色谱仪含GLP3250泵，可更换泵头两个（250ml）,GLP色谱工作软件，UC-3292检测器；超声清洗机，PH测定仪。

1.2  试剂与试药

氯仿，甲醇，氨水，硫酸，氢氧化钠，纯水（均为分析纯）；石杉碱甲对照品（99.1%含量）；千层塔来源于重庆，经鉴定符合中华人们共和国药典（2010版）规定。

1.3  色谱条件

分析条件：色谱柱（ID4.6×250mm，C18,粒径5μm）；流动相：甲醇—水（85：15）；流速：1ml/min；检测波长：231.3nm；进样体积10μl。

制备条件：色谱柱（ID63×700mm，Diamonsil C18,粒径25~40μm）；流动相：氯仿—甲醇—氨水（840：24:1.2）；流速：40ml/min；检测波长：311nm；进样体积5ml。

1.4  样品的处理

取药材粉碎，过20目筛，取干燥的千层塔粗粉1.6kg，加入10倍体积的PH为1的硫酸溶液，浸泡一段时间12小时，超生浸提几分钟，提取几次，合并酸液；加氢氧化钠溶液调PH至9，再加氯仿反复提取，并浓缩至膏。

1.5  石杉碱甲的制备

将按照1.4节方法制备的石杉碱甲固体提取物用制备色谱的流动相配制成体积为10mL的溶液，用孔径为0.45 μm的滤膜过滤，作为制备液。在1.3节制备色谱条件下开机，待基线稳定后进样，收集相应馏分，经蒸发浓缩，结晶即可，得石杉碱甲晶体。

1.6  制备样品的质量分数测定

精密称取按照1.5节制得的石杉碱甲2mg，用分析色谱流动相定容于10mL容量瓶中。按照石杉碱甲含量测定方法^[10]对所制得的样品进行石杉碱甲纯度检测,符合质量要求。

2  结果与讨论

2.1  流速对分离石杉碱甲的影响

将分析型液相色谱按比例扩大为制备型液相色谱时，尽可能使制备柱的固定相类型、溶剂组分等方面与分析柱保持一致，通常柱长保持大体相同，以增加柱径来达到更大的柱容量，这样，只考虑流速问题，可以从下面关系近似得到最大流速：

制备柱流速=×分析柱流速

根据石杉碱甲制备条件中流速大小^[11],结合上式，计算得出大流速为79.38 ml/min。

称取粉碎干燥的千层塔粗粉1.6kg（共7份），按照1.4和1.5节操作，以氯仿—甲醇—氨水（840：24:1.2）为流动相，考察不同流速对石杉碱甲分离效果的影响，结果见表1。

表1可知：随着流速的增大，石杉碱甲的保留时间逐渐减小，分离度降低，柱压升高；随着流速减小，保留时间延长，分离度增大，但流速太小时，保留时间过长，且色谱峰变宽；流速的变化对石杉碱甲纯度的影响不是很大，所以为了缩短分离时间，且保持良好的分离度，选择流动相的流速为40ml/min。

2.2  进样质量浓度对分离石杉碱甲的影响

分别称取粉碎、过筛、干燥的千层塔粗粉1000、1200、1400、1600、1800g，按照1.4和1.5节进行操作，考察了进样质量浓度对分离石杉碱甲的影响，结果见表2。

表1  流动相的流速对分离石杉碱甲的影响

由表2可知：随着进样质量浓度增大，保留时间逐渐增大，分离度降低，洗脱时间延长，所得石杉碱甲的质量分数降低；进样质量浓度低时分离度较高，洗脱时间较短，所得石杉碱甲的质量分数较高，但生产效率下降。为保证所制石杉碱甲既有较高的质量分数，又有较高的生产效率，选择进样质量浓度为160g(生药材)/mL。

2.3  进样量体积对分离石杉碱甲的影响

称取粉碎、过筛、干燥的千层塔粗粉1600g（共6份），按照1.4节进行操作，得6份石杉碱甲固体提取物，分别用制备色谱条件中的流动相配置成体积为2、3、4、5、6、7ml的制备样品溶液，用孔径为0.45 μm的滤膜过滤，得制备液。按1.3节制备色谱条件进行纯化分离，考察了进样质量体积对分离石杉碱甲的影响，结果见表3。

表2  进样质量浓度对分离石杉碱甲的影响

表3  进样量体积对分离石杉碱甲的影响

由表3可知：随着进样体积增大，石杉碱甲质量分数先增大又减小，分离度先增大后减小，保留时间逐渐增大，当进样体积大于7mL后，色谱分辨率降低，洗脱时间延长，所得冬凌草甲素的质量分数降低。进样体积不能太小，否则色谱分辨率太低，冬凌草甲素的质量分数降低。综合考虑，要分离制得质量分数高的产品，进样体积以5mL较好。

2.4  石杉碱甲质量分数测量结果

按照上述2.1-2.3节确定的条件分离制备了8批石杉碱甲样品，按照1.6节条件测定其质量分数，结果见表4，表中数据均为3次测定结果的算术平均值。

表4  石杉碱甲质量分数的测定结果

由表4可知，采用制备型高效液相色谱法所制得的石杉碱甲的质量分数较高，均能达到Huperzine A的纯度大于90%的技术要求。

3  结论

我们用制备型高效液相色谱法制备分离石杉碱甲。1.6kg千层塔可以得到近320mg的Huperzine A，重复性好，产品纯度达到了技术要求。本方法成本低，可为工业化生产工艺提供参考。

参考文献

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