本文通过测定高效液相色谱硅胶柱柱效的实验结果，表明所用的化合物、流动相、流动相流速、温度、进样量、进...

      液相色谱法是溶于液态流动相的各组分经过固定相时，由于与固定相发生吸附、分离、离子吸引、排阻、亲和等作用的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出，达到将混合组分分离目的的方法。它的应用，最早可追溯到20世纪初俄国植物学家茨维特（Tswett）利用碳酸钙吸附作用分离植物色素[1]；液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法。高效液相色谱法(HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，改变色谱柱填料，填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但也会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法[2]。液相色谱十分适合分离混合样品中的各个组分，高效液相色谱法(HPLC)针对试样提纯目的更具有分离速度快，效率高和应用范围广等优越性[3]。目前，高效液相色谱法(HPLC)已在研究开发和工业生产领域得到广泛应用[4-5]。
柱效是色谱柱对色谱中两种物质分离能力的大小。高效液相色谱法（HPLC）柱效测定的高低，不仅反映出填料性能，有时也反映出装填技术的好坏。所以测定柱效无论对生产填料或预装柱的生产者，还是对使用填料或预装柱的色谱工作者来说，都是很重要的。通过柱效的测定，生产者可以比较准确的进行质量控制，色谱工作者可根据测定的柱效选择合适的色谱柱和监督色谱柱使用过程中是否被污染。不同的色谱柱，固然有不同的柱效；但同一根色谱柱，测定柱效使用的方法不同，例如所用的化合物、流动相、流动相流速、温度、进样量、进样体积、半峰宽的测量等等不同，所得到的理论塔板数也不相同。当然，可以对对于所测定的柱效，附上有关的实验条件，但是，若将柱效的测定方法趋于一致，测定条件大致相同，生产者和色谱工作者会更加方便。
一  实验部分
1  仪器和试剂
制备型高压高效液相色谱柱（ID63×630mm）、动态轴向加压液压站：聊城万合工业制造有限公司；制备高压输液泵：GLP3250；紫外—可见检测器：UC-3292；Rheodyne3725i六通进样阀（配5ml定量环）；色谱工作软件及电脑。高效液相色谱仪，高速离心机，旋转蒸发仪。
二次重蒸水；正己烷，乙酸乙酯，苯，萘，乙苯（均为分析纯试剂，使用前先经过整流处理再用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤）。
2 试验方法
（1）柱效测试液的配制
准确移取苯、萘、乙苯若干于10ml容量瓶中，用正己烷定容，过0.45μm微孔滤膜，即得色谱柱柱效测试液。
（2）色谱条件
流速；
进样体积；
柱温：室温；
检测波长：UV254nm；
流动相：高效液相色谱（HPLC）中，可做流动相的溶剂很多[6]，然而，日常工作中可有商业提供的溶剂却很有限[7]。而且经常使用二元或多元溶剂的混合物作为流动相，以调节流动相的极性，改变洗脱强度或流动相的选择性。本文仅作了一元流动相正己烷和二元流动相正己烷-乙酸乙酯（90:10）、正己烷-乙酸乙酯（80:20）的对比试验。
3 试验过程
按照上述色谱条件进行测试，待系统平衡稳定后，用色谱工作站采集色谱数据，同时记录色谱数据文件名，用其“数据处理”系统处理数据文件并记录色谱峰的保留时间tR和相应色谱峰的半峰宽Y1/2。
二 结果与讨论
色谱柱是高效液相色谱仪的重要组件，无论是在保证纯化过程的稳定性还是保证最终产物的安全性上，填充柱的制备和质量认证都是极为重要的步骤。柱效在衡量柱子装填效果方面具有重要地位，通常用理论塔板数作为衡量指标，理论塔板数越大，柱效越高，分离效果越好。由Martin和Synger首先提出的塔板理论推导出来的理论塔板数柱效计算公式，长期以来被用于评价色谱柱，至今仍在延用[3]。

流动相体系	实验柱效（N/m）
	萘	苯	乙苯
正己烷	405268	38356	39526
正己烷-乙酸乙酯（90:10）	41598	39645	40589
正己烷-乙酸乙酯（80:20）	43589	40569	42287

2 温度
在高效液相色谱中，柱温影响着溶质扩散系数和流动相粘度[8]：随着柱温的升高，溶质扩散系数增大、流动相粘度降低，从而对保留时间、选择性产生影响，因此，柱温影响着理论塔板数的大小。华东理工大学李笃信等[9]等研究了高温液相色谱中温度对柱效的影响，得出柱效和温度的关系：H=a+bT+c/T（a、b、c为常数），升温过程中可以得到板高的一个最小值，取得最佳柱效。但是，由于受有机溶剂沸点的限制，高效液相色谱中温度可变化范围很小，而且温度升高，容易产生气泡，若进入柱子的流动相预热不足，会导致重复性比较差。由于这些原因，测定柱效的温度建议采用室温。
3 进样量和进样体积
高效液相色谱柱具有一定的饱和容量和最大进样体积，他们决定于化合物分子在固定相和流动相中的平衡。一般来说，随着进样量的增大，柱效降低；当进样量超出色谱柱的饱和容量时，柱效显著降低。对于一定的样品量，进样体积增大，柱效降低，当超出色谱柱的最大进样体积时，柱效明显减低，影响分离效果。对于色谱分析柱，所需要的进样量和进样体积都很小，远远小于色谱柱的饱和容量和最大进样体积，因此，进样量和进样体积对定性定量的色谱分析柱柱效影响不大。但进样量和进样体积对制备型色谱柱柱效测量有很大影响，应注意不要超出色谱柱的进样饱和容量和最大进样体积。总体来说，在色谱柱的线性容量范围内，进样量和进样体积对柱效的影响不明显（见表2，流动相为二元流动相正己烷-乙酸乙酯（80:20），试样为萘，温度为室温）。
 

进样量（g/5ml）	0.2	0.4	0.5	2	5
柱效(N/m)	44256	44249	43895	40256	36895
进样体积(ml/0.5g)	1	2	5	10	15
柱效(N/m)	44589	44289	43956	38852	35987

从上表可以看出，在一定的范围内，随着进样量和进样体积的变化，理论塔板数值变化不明显，但超出了这个范围，柱效明显降低。
4 流动相流速
1956年荷兰学者范·第姆特（Van Deemter）等人提出了速率理论[10]，表述了影响柱效的各种因素，提出了流动相流速影响保留时间和色谱峰扩展，并由速率方程（也成范·第姆特方程式）推出流速影响柱效总存在一个最佳流速。对于分析型色谱柱，根据各种经验，建议采用1ml/min左右的流动相流速。对于制备型色谱柱，一般与直径的平方成正比，建议利用标准色谱柱[10]和经验公式：
制备柱流速=（）2×分析柱流速
               =（）2×1
               =（）2
制备柱内径单位为mm。
5 半峰宽
峰宽是指峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。半峰宽（p是—峰高一半处的峰宽。半峰宽的测量现在大都可以从工作站软件中直接得到，影响不大。
6 填料
对于一些非预装柱，还应考虑填料，应注意填料的生产厂家和生产批号。
三 结论
由以上实验及分析可以看出，影响柱效测定的因素是很多的。测定的方法不同，得到的柱效肯定不同，所以测得的柱效应附上以上所有实验条件，否则只说某一填料或柱子的柱效太过笼统，容易产生歧义。所以最好的办法是使柱效测定方法趋于统一化，至少大体相同，这样，对填料和柱子的评价有了共同语言，可以减少很多不必要的纠纷。并且，质量控制也有了依据，用户可以更好的了解产品的性能。
参考文献
[1]  成都中医学院编著. 中药学,上海科学技术出版社，1978,1,89，123
[2]  王志祥、莫芬珠、余国琮. 制备型液相色谱分离技术进展,化工时代，1997，11（5），12-17
[3] 陈怡文，等. 有机仪器分析.长沙：湖南大学出版社,1987.
[4]  Colin H. Analusis, 1998,（26）：M15-M17
[5]  祁彦（Qi Y）,黄骏雄（Huang J X）. 化学进展（Progress in Chemistry）,2001:13（4）：294-302
[6]  L.R.Snyder,J.Chem,Sct. 1978;16:223
[7]  S.R.Bakalyar,Amerlcan Laboratory,1978:43
[8]  成洪达，李彤，张维冰。现代科学仪器[J].2006,109：74-78
[9]  李笃信，兰韬，王风云等.高温液相色谱中温度对柱效的影响，第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集：1150-1151
[10] 刘国诠，余兆楼编. 色谱柱技术. 北京：化学工业出版社，2001
[11] 中华人民共和国机械行业标准，JB-5226-91