赵新燕 周建民 秦学

（聊城万合工业制造有限公司，山东 聊城252022）

冬凌草为唇形科植物碎米桠[Rabdosia rubescens(Hamst)C.Y.Wu.et Hsuan]的干燥地上部分，主要分布于我国黄河流域及其以南各地区，主产于河南太行山南麓各地。冬凌草具清热解表、消炎止痛、健胃活血等功效，在抗肿瘤方面有较强的活性。冬凌草甲素为冬凌草的有效活性成分，研究^[1]发现，生长在河南济源太行山区8月份冬凌草叶中冬凌草甲素含量最高，它是一种对映贝壳杉烯二萜类化合物。

冬凌草甲素对各种移植性肿瘤细胞具有较大的杀伤，抑制增殖能力，临床上主要用来治疗胃癌、食道癌等症。冬凌草甲素目前主要从冬凌草植物中分离纯化得到，提取方法主要为乙醚提取法、乙醇提取法及中压柱色谱法等，但这些提取工艺操作周期长，条件不易控制，得到的冬凌草甲素的含量低^[2-5]。

本文采用反相制备色谱法分离纯化了冬凌草甲素，分离工艺简单，提取率高，所得产品纯度高，无污染，为进一步工业化制备型液相色谱分离纯化冬凌草甲素提供了基础。

1  仪器与试药

高效液相色谱仪含GLP3250泵，可更换泵头两个（250ml）,GLP色谱工作软件，UC-3292检测器；超声清洗机，PH测定仪。试剂：甲醇，纯水，体积分数95%乙醇（均为分析纯）；冬凌素甲素对照品由河南医科提供经高效液相色谱检测纯度大于99.5%；冬凌草产自河南济源市。

2  制备条件

分析条件：色谱柱（ID4.6×250mm，C18,粒径5μm）；流动相：甲醇—水（60：40）；柱温：38℃，流速：1ml/min；检测波长：239nm；进样体积10μl。

制备条件：色谱柱（ID63×700mm，Diamonsil C18,粒径25~40μm）；流动相：甲醇—水（55:45）；流速：35ml/min；检测波长：239nm；进样体积5ml。

3  冬凌草甲素的制备

3.1 样品的处理

参考文献^[6-7]并考虑到各种成本，选用体积分数为95%的乙醇进行热回流提取。取冬凌草干草粉末120g，放到预热至80℃的1200ml 95%热乙醇中，保温回流30min，过滤得提取液。将沉淀再次提取2次，将所有提取液浓缩成膏，即粗品。

3.2  冬凌草甲素的纯化

将上节方法制备的冬凌草甲素粗品用制备条件中的流动相配制成体积10mL的溶液，用0.45 μm孔径的滤膜过滤，作为制备液备用。在2节制备色谱条件下开机，每次进样5ml，收集相应的流出液，蒸发浓缩干燥，得冬凌草甲素白色粉末。

3.3  制备样品的质量分数测定

用万分之一电子天平准确称取上节制得的冬凌草甲素5mg，用分析色谱条件流动相溶解，定容于25mL容量瓶中，按照反相高效液相色谱测定法^[8]进行纯度测定，制备的样品冬凌草甲素质量分数大于99%。

4  结果与讨论

4.1  流动相的选择

流速35ml/min，进样量5ml，考察不同组成流动相下的分离效果和回收率，结果如表1所示。由表1可见，随着溶剂极性的增大，分离度、保留时间及冬凌草甲素的质量分数逐渐增大，而回收率逐渐减少，综合分析，选择甲醇：水为55:45的溶剂体系作为流动相。

4.2  流速的选择

以甲醇-水（55:45）作为流动相，进样体积为5ml，测试了流速分别为20、25、30、35、40、45、50ml/min条件下的样品分离度、保留时间及纯度，结果如表2。由表2可见，随着

表1  流动相组成对分离冬凌草甲素的影响

表2  流动相的流速对分离冬凌草甲素的影响

流速的增大，冬凌草甲素的保留时间逐渐减少，分离度降低，样品质量分数先增大后减小，在流速大于35ml/min的条件下，样品质量分数显著下降。综合考虑分离周期、分离度等，选择以35ml/min为流动相的流速。

4.3  进样质量浓度的选择

以甲醇-水（55:45）作为流动相，流速控制在35ml/min，测试了样品在不同进样质量浓度下的分离效果，结果见表3.由表3可见，随着进样质量浓度的增大，色谱保留时间增长，色谱宽度变大，分离度减小，冬凌草甲素质量分数降低。为保证有较高的生产效率，较高的质量分数，选择进样质量浓度为15g/ml。

表3  进样质量浓度对分离冬凌草甲素的影响

5  结论

采用制备液相色谱法分离纯化冬凌草甲素，分离效果好，分离周期短，所用溶剂对环境无污染。本工艺若120g冬凌草可提取得370mg冬凌草甲素，收率高，可供工业化生产工艺参考。

参考文献

[1]   袁珂,胡润淮,杨怡,等.TLC测定冬凌草叶中冬凌草甲、乙素的含量[J].中国药学杂志,1998,33(10):611-613.

[2]   云南省医学科学研究所药理药化组.冬凌草甲素的化学及药理作用研究[J]. 中草药通讯，1977,(10):5一7.

[3]   袁珂,胡润淮,冀春茹,等.柱层析法分离制备冬凌草甲素的新工艺[J] .中国中药杂志,1997，22(8):478一482.

[4]   赵伟,郭兆霞.中压柱层析法提取分离冬凌草甲素的新工艺[J].黑龙医药,2001,14(1):6-7.

[5]   邢洁，张典瑞，张学顺,等.超临界CO2萃取-柱色谱分离联用制备冬凌草甲素的新工艺的研究[J].中国药学杂志，2005,40 (23) :1804 一1806.

[6]   徐礼，沙世炎，曾纪琰，等.中草药有效成分分析法,下册[M].北京:人民卫生出版社,1984 ：110.

[7]   李吉学，李燕杰，陈百泉.冬凌草甲素提取纯化方法[J].河南大学学报, 2010,29 (1):10-12.

[8]   李志平,胡江宇,银永忠,颜文彬.反相高效液相色潽法测定冬凌草茶中的冬凌草甲素[J].生命科学仪器，2005，3（6）：38-40.